Edité par Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Californie, approuvé le 25 décembre 2020 (révisé le 25 octobre 2020)
Nous rapportons l’interaction entre les sous-unités dans la réplication des complexes coronavirus-transcription, qui sont essentiels à la réplication et à la conservation évolutive.Nous avons fourni la preuve que le domaine NiRAN associé à nsp12 possède une activité nucléoside monophosphate (NMP) transférase en trans et avons identifié nsp9 (une protéine de liaison à l'ARN) comme sa cible.NiRAN catalyse la fixation covalente du fragment NMP à l'extrémité amino nsp9 conservée dans une réaction qui repose sur les ions Mn2+ et les résidus Asn conservés adjacents.Il a été constaté que l’activité NiRAN et la NMPylation nsp9 sont essentielles à la réplication du coronavirus.Les données nous permettent de relier cette activité du marqueur enzymatique du virus imbriqué aux observations précédentes dans l’hypothèse que l’initiation de la synthèse d’ARN dans une classe de virus à ARN est cohérente sur le plan fonctionnel et évolutif.
L'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRps) des Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae et 12 autres familles) est liée au domaine amino-terminal (N-terminal) de la protéine non structurelle (nsp) libérée par la polyprotéine, appelée NiRAN. 1ab est composé de protéase principale virale (Mpro).Auparavant, la propre activité GMPylation/UMPylation du virus artériel NiRAN-RdRp nsp avait été rapportée, et il a été suggéré de générer un transitoire pour le transfert du nucléoside monophosphate (NMP) vers le virus (actuellement inconnu) et/ou les choses de biopolymérisation cellulaire.Ici, nous montrons que le coronavirus (Coronavirus humain [HCoV]-229E et Coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère) nsp12 (NiRAN-RdRp) a une activité de NMPylation dépendante de Mn2+, qui est dérivée de nsp9 par la formation de nsp9 médié par Mpro après la nsps flanquante N-terminale est libérée par protéolyse, le phosphoramidate est lié à l'amine primaire (N3825) au niveau de l'extrémité N-terminale de nsp9.L'uridine triphosphate est le nucléotide préféré dans cette réaction, mais l'adénosine triphosphate, la guanosine triphosphate et la cytidine triphosphate sont également des co-substrats appropriés.Des études de mutation utilisant les protéines recombinantes nsp9 et nsp12 du coronavirus et des mutants HCoV-229E génétiquement modifiés ont déterminé les résidus nécessaires à la NMPylation nsp9 médiée par NiRAN et à la réplication du virus en culture cellulaire.Les données ont confirmé la prédiction des résidus du site actif NiRAN et ont déterminé le rôle important des résidus nsp9 N3826 dans la NMPylation de nsp9 et la réplication du virus in vitro.Ce résidu fait partie de la séquence tripeptidique N-terminale NNE conservée et s’est avéré être le seul résidu invariant de nsp9 et de ses homologues dans la famille des coronavirus.Cette étude fournit une base solide pour l'étude fonctionnelle de l'activité de NMPylation d'autres virus nichés et propose des cibles possibles pour le développement de médicaments antiviraux.
Le virus à ARN positif Nidovirales infecte une variété de vertébrés et d’invertébrés (1, 2).L’ordre comprend actuellement 14 familles (3), parmi lesquelles la famille des Coronavirus a été largement étudiée ces 20 dernières années.À cette époque, trois coronavirus zoonotiques ont émergé d’hôtes animaux et ont provoqué des épidémies à grande échelle d’infections respiratoires graves chez l’homme.Y compris les pandémies persistantes causées par des maladies infectieuses aiguës graves.Syndrome respiratoire Coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) (4âââ7).Les nidovirus partagent une organisation génomique commune, et la sous-unité du complexe de réplication-transcription (RTC) lié à la membrane est codée dans les deux tiers 5-?²-terminaux et dans la sous-unité structurelle principale de la particule virale, ainsi que dans certains accessoires. .Protéine, codée dans le tiers terminal 3??² du génome (1).À l'exception d'une famille de virus planaires (Monoviridae) (8), tous les virus imbriqués codent pour des sous-unités RTC dans deux grands cadres de lecture ouverts (ORF) ORF1a et ORF1b, qui sont traduits à partir de l'ARN génomique de.ORF1a code pour la polyprotéine (pp) 1a, et ORF1a et ORF1b codent conjointement pour pp1ab.Avec la participation générale de la protéase principale (Mpro) codée par ORF1a, pp1a et pp1ab sont transformées protéolytiquement en une variété de protéines non structurelles (nsps), également connues sous le nom de 3CLpro, car elles présentent une homologie avec la 3Cpro du picornavirus ( 9).On pense que ces nsps sont assemblées dans un grand RTC dynamique, catalysent la synthèse d'ARN génomique (réplication) et d'un ensemble d'ARN sous-génomiques (transcription), et sont utilisées pour coordonner l'expression de l'ORF situé en aval de ORF1b (10? ? ?12).
Le RTC de base comprend l'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) (13), l'hélicase de la superfamille 1 (HEL1) (14, 15) et plusieurs enzymes de traitement de l'ARN, qui sont principalement codées dans ORF1b et dans la famille des coronavirus. Il contient nsp12-nsp16 et nsp9-nsp12 dans la famille des Arterioviridae (voir référence 10ââ 12).RdRp et HEL1 représentent deux (un cinquième) domaines conservés du virus du nid d'oiseau et présentent une homologie avec d'autres virus à ARN.On pense que la réplicase centrale est assistée par d’autres sous-unités, notamment plusieurs petites nsps libérées par la région carboxy-terminale (C-terminale) de pp1a, en aval de Mpro (coronavirus nsp5 et arterial virus nsp4, respectivement).Ils bénéficient d'une protection familiale limitée et d'activités diverses (examinées dans la référence 10ââ12).
Relativement récemment, un domaine avec des caractéristiques de motif de séquence uniques a été trouvé à l'extrémité amino-terminale (extrémité N) adjacente à RdRp dans tous les virus imbriqués, mais dans aucun autre virus à ARN (16).En fonction de son emplacement et de son activité de nucléotide transférase (nucléoside monophosphate [NMP] transférase), ce domaine est nommé NiRAN (Nestvirus RdRp-rated nucléotide transférase).La combinaison à double domaine de NiRAN-RdRp constitue nsp12 dans la famille des Coronaviridae et nsp9 dans la famille des Arterioviridae, et chez d'autres nestoviridae, NiRAN-RdRp devrait être libéré en tant que nsp indépendant de la polyprotéine virale.Dans le coronavirus, le domaine NiRAN contient 1/450 résidus et est connecté au domaine RdRp C-terminal via la région de liaison (16–19).Dans le virus de l'artérite équine (EAV) (Arteriviridae), le nsp9 recombinant présente des activités d'UMPylation et de GMPylation (auto)dépendantes des ions Mn2+, qui dépendent de trois bases de séquence conservées dans le nestovirus, AN, BN et CN des résidus dans la séquence.Où N représente NiRAN) (16).Le flanc N-terminal de ces motifs est un motif préAN moins conservateur.Certains de ces résidus sont également conservés dans des protéines kinases éloignées, où il a été démontré qu'ils sont impliqués dans la liaison du nucléoside triphosphate (NTP) et dans l'activité catalytique (20, 21).Conformément à cette observation, plusieurs résidus clés du site actif dans la pseudokinase SelO de Pseudomonas syringae peuvent être assemblés avec le supercomplexe SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 récemment publié.Résidus NiRAN du coronavirus conservés superposés dans la microstructure électronique.Protéine recombinante (17).On suppose que l'(auto)U/GMPylation documentée produira un état transitoire pour transférer la NMP vers le substrat (actuellement inconnu) (16), et la similarité structurelle entre NiRAN et la protéine kinase (17, 19) est l'hypothèse selon laquelle NiRAN modifie d'autres protéines.
De nombreuses caractéristiques, notamment son association systématique unique avec les virus imbriqués et sa séparation génétique du RdRp, font de NiRAN une enzyme régulatrice clé raisonnable pour les virus imbriqués, essentielle à leur émergence et à leur identité.Auparavant, trois fonctions possibles impliquant NiRAN pour réguler la traduction ou la réplication/transcription du génome/sous-génomique étaient appelées.Si l’on considère les données rares et incomplètes disponibles à l’époque, chaque fonction présente ses avantages et ses inconvénients (16).Dans cette recherche, nous visons à combiner les études biochimiques et génétiques inverses des coronavirus représentant les deux genres, et à placer nos découvertes dans le contexte évolutif de la mutation naturelle de la famille des coronavirus, afin de mieux comprendre ce royaume mystérieux.Nous rapportons des avancées majeures dans la compréhension de NiRAN grâce à l’identification de cibles naturelles dans le RTC, qui (parmi les trois hypothèses disponibles) contribue au rôle de ce domaine dans l’initiation de la synthèse d’ARN viral emboîté.Cette recherche ouvre également des possibilités pour d’autres rôles de NiRAN sur l’interface hôte du virus.
Afin de caractériser les propriétés enzymatiques du domaine NiRAN lié au virus corona nsp12, nous avons produit une forme recombinante du coronavirus humain 229E (HCoV-229E) nsp12 dans E. coli, avec une étiquette His6 à l'extrémité C-terminale, et avons combiné le protéine avec [α32-P] Incuber avec NTP en présence de MnCl2 comme décrit dans Matériel et méthodes.L'analyse du produit de réaction a indiqué la présence d'une protéine radiomarquée co-migrant avec nsp12 (106 kDa), indiquant que le coronavirus nsp12 catalyse la formation d'adduits covalents protéine-NMP, préférentiellement formés avec le monophosphate d'uridine (UMP) (Figure 1A). B).L'analyse quantitative a montré que par rapport à d'autres nucléotides, l'intensité du signal d'incorporation d'UMP augmentait de 2 à 3 fois (Figure 1C).Ces données sont cohérentes avec l’activité NMP transférase prévue du domaine NiRAN du coronavirus (16), mais indiquent que les préférences nucléotidiques du domaine NiRAN du coronavirus et du virus artériel sont différentes.
Activité d’auto-NMpylation du HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) a été incubé avec le [α-32P] NTP désigné en présence de 6 mM de MnCl2 pendant 30 minutes (voir Matériels et méthodes pour plus de détails).Les produits de réaction ont été séparés par SDS-PAGE et colorés au bleu brillant de Coomassie.(B) La protéine radiomarquée est visualisée par imagerie au phosphore.Les positions des marqueurs de masse moléculaire nsp12-His6 et protéiques (en kilodaltons) sont indiquées en A et B. (C) L’intensité du signal radioactif (moyenne ± SEM) a été déterminée à partir de trois expériences indépendantes.*P≤0,05.La force du signal (pourcentage) est liée à l'UTP.
Bien que les activités enzymatiques liées au NiRAN se soient révélées essentielles à la réplication de l’EAV et du SRAS-CoV en culture cellulaire (16), la fonction spécifique du NiRAN et les cibles potentielles n’ont pas encore été déterminées.La similarité structurelle récemment rapportée entre NiRAN et une famille de protéines présentant des replis de type protéine kinase (17, 22) nous a incité à tester l'hypothèse selon laquelle NiRAN catalyse la NMPylation d'autres protéines.Nous avons généré un ensemble de cibles homologues potentielles, y compris des protéines non structurales codées par HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), chacune contenant une étiquette His6 C-terminale (annexe SI, tableau S1), et incuber ces protéines avec du [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) en présence ou en absence de nsp12.L'albumine sérique bovine et la protéine de fusion MBP-LacZα produites dans E. coli ont servi de contrôles (Figure 2A, pistes 1 à 7).La protéine radiomarquée a été analysée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) et autoradiographie, et il a été constaté qu'il y avait un fort signal radioactif dans la réaction contenant nsp12 et nsp9.La position du signal correspond à la masse moléculaire de nsp9, indiquant une UMPylation de nsp9 médiée par nsp12 (Figure 2B, piste 7).Aucune autre protéine testée n'a été trouvée UMPylée, ce qui nous a amené à conclure que nsp9 est un substrat spécifique de nsp12.Conformément aux données d'auto-NMPylation présentées dans la figure 1, nsp12 est capable de transférer les quatre NMP vers nsp9, bien que l'efficacité soit différente, UMP> adénosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Image).3A et B).Dans les conditions utilisées dans cet essai (raccourcir le temps de réaction et d'exposition, réduire la concentration de nsp12 ; matériels et méthodes), l'auto-NMPylation de nsp12 n'a pas pu être détectée (comparer la figure 2B, la piste 7 et la figure 1B), ce qui s'est avéré un UMP efficace (et plusieurs tours) passé de nsp12 à nsp9.L'activité UMP transférase nécessite la présence d'ions Mn2+, comme le montre la figure 3C, alors que seule une activité UMP transférase minimale a été observée en présence de Mg2+, et aucune activité en présence des deux autres cations divalents testés.Des données similaires ont été obtenues dans des tests de NMPylation contenant du triphosphate de cytidine (CTP), du triphosphate de guanosine (GTP) et de l'adénosine triphosphate (ATP) (annexe SI, figure S1).
UMPylation de nsp9 médiée par HCoV-229E nsp12.Une série de substrats protéiques (y compris l'albumine sérique bovine, MBP-lacZα et une série de nsps HCoV-229E marquées avec His6 C-terminal codé par ORF1a) ont été utilisées pour évaluer l'activité d'UMPylation du HCoV-229E nsp12-His6⁺ médiée. protéine.Incuber la protéine avec [α-32P] UTP pendant 10 minutes en l’absence (A) ou en présence (B) de nsp12 comme décrit dans les matériels et méthodes.En haut de A et B, le gel SDS-polyacrylamide coloré au Coomassie Brilliant Blue est affiché, et en bas de A et B, les autoradiogrammes correspondants sont affichés.La position du marqueur de masse moléculaire des protéines (en kilodaltons) est indiquée à gauche.La position de nsp12-His6 (B, en haut) et le signal radioactif observé lors de l'incubation de nsp12-His6 avec nsp9-His6 (B, piste 7) sont également indiqués, ce qui indique que [α-32P]UMP à nsp9-His6 ( 12,9 kDa), ce qui n'a pas été observé pour les autres protéines testées.
Caractérisation biochimique et virologique médiée par HCoV-229E NiRAN de la NMPylation de nsp9.(A et B) Le rôle du co-substrat nucléotidique utilisé dans la réaction.Nsp12-His6 et nsp9-His6 sont mélangés et incubés en présence de différents [α-32P] NTP dans le test standard de NMPylation.(A, en haut) Nsp9-His6 coloré au Coomassie séparé par SDS-PAGE.(A, en bas) Autoradiographie de la même zone du gel.(B) L’activité relative (moyenne ± SEM) en présence du cofacteur nucléotidique désigné est déterminée à partir de trois expériences indépendantes.*P≤0,05.(C) Le rôle des ions métalliques.Le test de NMPylation standard est présenté en présence de [α-32P] UTP et de différents ions métalliques, chacun avec une concentration de 1 mM.En C, en haut, le nsp9-His6 coloré au Coomassie est présenté, et en C, en bas, l'autoradiographie correspondante est présentée.La taille de la protéine marquée (en kilodaltons) est indiquée à gauche de A et C. (D) La forme mutante de HCoV-229E nsp12-His6 portant la substitution d'acide aminé spécifiée est en [α-32P]UTP, comme décrit en Matériels et Méthodes.Le nsp9-His6 radiomarqué produit dans la réaction de NMPylation est détecté par imagerie de phosphorylation (D, en haut).L'activité relative par rapport à la protéine de type sauvage (poids) est indiquée en D, et le fond est considéré comme la moyenne (± SEM) de trois expériences indépendantes.Les astérisques indiquent les substitutions de résidus non conservés.(E) Le titre de virus dans le surnageant de culture de cellules p1 obtenu 24 heures après l’infection a été déterminé par test sur plaque.Les substitutions de codons dans le domaine NiRAN du mutant HCoV-229E modifié sont indiquées (la numérotation des résidus est basée sur leur position dans pp1ab).Le mutant du site actif RdRp déficient en réplication nsp12_DD4823/4AA a été utilisé comme contrôle.
Afin de mieux comprendre le site actif de NiRAN et de déterminer les résidus liés à l'activité de la NMP transférase spécifique de nsp9, nous avons effectué une analyse de mutation dans laquelle nous avons remplacé les résidus conservateurs dans les motifs NiRAN AN, BN et CN ( 16) Il s'agit d'Ala (annexe SI, figure S2).De plus, l’impact des substitutions conservatrices Arg-to-Lys ou Lys-to-Arg a été évalué dans deux cas.En guise de contrôle (négatif), les résidus qui ne sont pas ou moins conservés dans le domaine NiRAN des coronavirus et autres virus imbriqués sont remplacés par Ala. En remplacement de K4116A (dans le motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif BN) et D4280A (CN) réduisent significativement voire éliminent la NMPylation de nsp9 via nsp12, tandis que les protéines avec substitutions conservatrices (R4178K, K4116R) conservent 60% et 80% de leur activité, ce qui indique que l'assouplissement des restrictions de leur côté respectif chaînes est physicochimiquement sensible (Figure 3D).Le remplacement de plusieurs autres résidus conservés E4145A, D4273A, F4281A et D4283A est beaucoup moins nocif et l'UMpylation de nsp9 n'est que modérément réduite.Des résultats similaires ont été obtenus dans des réactions de NMPylation nsp9 impliquant d'autres NTP (Figure 3D et annexe SI, Figure S3), confirmant que les effets observés sur les substitutions d'acides aminés spécifiques sont indépendants du type de co-substrat nucléotidique utilisé.Ensuite, nous avons testé l’impact possible de ces substitutions nsp12 sur la réplication des coronavirus en culture cellulaire.À cette fin, nous avons utilisé des modèles d'ADN complémentaire (ADNc) génétiquement modifiés appropriés, clonés dans le virus de la vaccine recombinant (23, 24) pour transcrire 5 à 7 cellules.Le titrage de la descendance du virus infectieux produit dans ces cellules a montré que la plupart des mutants HCoV-229E NiRAN n’étaient pas réalisables (Figure 3E).Un groupe de mutants viraux non viables comprend des alternatives qui éliminent ou réduisent considérablement l'activité de la NMP transférase in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), mais il existe deux autres alternatives (K4116R, E4145A)80. % réservé ?Leur activité de NMPylation in vitro suggère que des restrictions supplémentaires sont impliquées.De même, deux autres mutations (R4178K, F4281A) qui ont provoqué une diminution modérée de l'activité de NMPylation in vitro de NiRAN ont produit des virus vivants, cependant, ces virus ont considérablement réduit les titres par réplication.Conformément aux données d'activité in vitro présentées sur la figure 3D, le remplacement de quatre autres résidus non conservés dans le coronavirus et/ou d'autres virus imbriqués (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) a produit des virus viables. La progéniture, bien qu'elle ait un titre modérément réduit par rapport au virus de type sauvage (Figure 3E).
Afin d'étudier si l'activité de la NMP transférase médiée par NiRAN dépend du domaine RdRp actif, les deux résidus Asp conservés impliqués dans la coordination des ions métalliques divalents (11) dans le motif C RdRp ont été remplacés par Ala. La protéine résultante nsp12_DD4823/4AA conserve son activité de NMPylation nsp9, indiquant que l'activité de NMPylation nsp9 in vitro médiée par nsp12 ne nécessite pas d'activité polymérase (Annexe SI, Figure S4).
Après avoir établi l'activité NMP transférase spécifique à nsp9 pour nsp12, nous avons essayé de caractériser l'adduit NMP-nsp9 par spectrométrie de masse (MS).Le spectre de masse protéique complet du HCoV-229E nsp9 recombinant a montré un pic à 12 045 Da (Figure 4A).L'ajout de nsp12 n'a pas modifié la qualité de nsp9, ce qui indique que nsp12 et nsp9 ne formeraient pas un complexe stable dans les conditions utilisées (dénaturation) (Figure 4A).En présence d'UTP et de GTP, la mesure de masse de la réaction contenant respectivement nsp9 et nsp12 a montré que la masse protéique de l'UTP s'est déplacée de 306 Da et que la masse protéique du GTP s'est déplacée de 345 Da, indiquant que chaque molécule de nsp9 se lie à un UMP ou un GMP. (Photo 4) C et D).On suppose que l’énergie requise pour la NMPylation de nsp9 médiée par NiRAN provient de l’hydrolyse du NTP et de la libération de pyrophosphate.Bien qu'un excès molaire de 10 fois de nsp9 (cible) par rapport à nsp12 (enzyme) ait été utilisé dans cette réaction, une NMPylation presque complète de nsp9 a été observée, indiquant que l'interaction entre nsp12 et nsp9 est de courte durée et que nsp12 peut NMPyler davantage de nsp9. molécule in vitro.
NMPylation unique de nsp9 en présence de nsp12 et UTP ou GTP.Le spectre de masse protéique complet déconvolué du HCoV-229E nsp9 (annexe SI, tableau S1) (AD) est présenté.(A) nsp9 seul, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 en présence d’UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 en présence de GTP.
Pour déterminer les résidus nsp9 UMPylés par nsp12, nsp9-UMP a été clivé avec de la trypsine.Les peptides résultants ont été séparés par chromatographie liquide nano-haute performance (HPLC) et analysés par spectrométrie de masse tandem (MS/MS) en ligne.L'analyse des données à l'aide du progiciel Byonic (Protein Metrics) a montré une UMPylation de l'acide aminé N-terminal.Ceci est confirmé manuellement.Le spectre de masse en tandem du peptide précurseur [UMP] NNEIMPGK (annexe SI, figure S5A) a révélé un fragment à 421 m/z, indiquant que l'UMP se lie au résidu 1 de nsp9.
À l'extrémité N de nsp9, Asn est conservé parmi les membres des Orthocoronavirinae (annexe SI, figure S6).Bien que nous pensions que l’azote de l’amine primaire N-terminale est l’accepteur le plus probable de l’UMP, nous avons décidé d’obtenir des preuves supplémentaires de la liaison de la NMP au niveau N-terminal.Pour cette raison, le peptide N-terminal nsp9 non NMPylé et NMPylé purifié par HPLC a été dérivé en présence d'acétone et de cyanoborohydrure de sodium.Dans ces conditions, seules les aminés primaires libres peuvent être modifiées par du propyle (25).Le peptide dérivé de nsp9 N-terminal avec la séquence NNEIMPGK contient deux amines primaires, l'une à l'extrémité N-terminale d'Asn et l'autre au niveau de la chaîne latérale de Lys à l'extrémité C-terminale.Par conséquent, des groupes propyle peuvent être introduits aux deux extrémités.Les chromatogrammes ioniques extraits de peptides non NMPylés sont présentés dans l'annexe SI, figure S5B.Comme prévu, les peptides (mono)propylés N-terminaux et C-terminaux (annexe SI, figure S5B, voie supérieure) et dipropylés (annexe SI, figure S5B, voie inférieure) peuvent être identifiés.Ce modèle change avec l’utilisation du peptide NMPylé N-terminal de nsp9.Dans ce cas, seuls les peptides propylés C-terminaux peuvent être identifiés, mais les peptides propylés N-terminaux et les peptides dipropylés ne sont pas identifiés (Annexe SI, Figure S5C), ce qui indique que l'UMP a été transféré à l'amine primaire N-terminale. Pour éviter cela groupe de faire des changements.
Ensuite, nous remplaçons (par Ala ou Ser) ou supprimons les résidus conservés à l'extrémité N-terminale de nsp9 pour définir des contraintes spécifiques à la cible.Sur la base de nos données MS montrant que NiRAN forme un adduit nsp9-NMP avec l'amine primaire du résidu N-terminal de nsp9, nous avons émis l'hypothèse que la NMPylation de nsp9 nécessite la protéase maîtresse virale (Mpro, nsp5) pour libérer le N-terminal nsp9 de son précurseur polyprotéique.Pour tester cette hypothèse, nous avons produit une protéine précurseur nsp7-11 contenant nsp9 dans E. coli et effectué un test standard de NMPylation en présence de [α-32P] UTP (matériels et méthodes).Comme le montre la figure 5A (piste 3), le précurseur nsp7-11 non coupé n'est pas radiomarqué avec nsp12.En revanche, si nsp7-11 est clivé par nsp5 recombinant pour libérer nsp9 (et d'autres nsps) du précurseur, une protéine radiomarquée qui migre avec nsp9 est détectée, confirmant notre conclusion selon laquelle NiRAN et N- Formation sélective d'adduits covalents nsp9-NMP .L'amine primaire terminale de l'Asn N-terminal (position 3825 dans pp1a/pp1ab).Cette conclusion est également étayée par des expériences utilisant la construction nsp9, qui contient un ou deux résidus supplémentaires à l'extrémité N-terminale.Dans les deux cas, l'UMpylation de nsp9 médiée par NiRAN a été supprimée (annexe SI, figure S7).Ensuite, nous avons produit une protéine avec un ou deux résidus Asn supprimés de la séquence peptidique 3825-NNEIMPK-3832 au niveau N-terminal de nsp9.Dans les deux cas, l'UMPylation de nsp9 a été complètement bloquée (Figure 5B), fournissant une preuve supplémentaire que la véritable extrémité N de nsp9 agit comme un récepteur NMP.
Le traitement protéolytique de nsp9 et le rôle des résidus N-terminaux dans l'UMPylation médiée par nsp12.(A) L’UMpylation nsp9 nécessite un N-terminal nsp9 libre.Nsp7-11-His6 est pré-incubé à 30 °C dans un tampon de détection de NMPylation contenant de l'UTP en présence ou en absence de Mpro recombinant (nsp5-His6).Après 3 heures, démarrez le test NMPylation en ajoutant nsp12-His6 comme décrit dans Matériels et méthodes.La réaction contenant nsp5-His6 (piste 1) et nsp9-His6 (piste 2) a été utilisée comme contrôle.Au bout de 10 minutes, la réaction a été terminée et le mélange réactionnel a été séparé par SDS-PAGE.La protéine a été colorée au Coomassie Brilliant Blue (A, en haut).Le précurseur Nsp7-11-His6 et le produit traité résultant du clivage médié par nsp5-His6 sont présentés à droite.Veuillez noter (en raison de leur petite taille) que nsp7 et nsp11-His6 ne sont pas détectables dans ce gel et que la réaction est complétée par nsp5-His6 (pistes 1 et 4 ; la position de nsp5-His6 est indiquée par un cercle plein) ou nsp9-His6 (piste 2) contient une petite quantité de MBP (indiquée par des cercles ouverts) comme impuretés résiduelles car elles sont exprimées en protéines de fusion MBP (annexe SI, tableau S1).(B) Le variant Nsp9-His6 manque d’un ou deux résidus Asn N-terminaux (numérotation des résidus en fonction de la position dans pp1a/pp1ab) et est purifié et incubé avec nsp12-His6 et [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE colorée au Coomassie est affichée en haut, B, l'autoradiographie correspondante est affichée en bas.La position du marqueur de poids moléculaire (en kilodaltons) est indiquée à gauche.(C) Les résidus conservés N-terminaux HCoV-229E nsp9-His6 ont été remplacés par Ala ou Ser, et la même quantité de protéine a été utilisée dans la réaction d'UMPylation médiée par nsp12-His6.Les produits de réaction ont été séparés par SDS-PAGE et colorés au bleu brillant de Coomassie (C, en haut), et le nsp9-His6 radiomarqué a été détecté par imagerie par phosphorescence (C, au milieu).En utilisant la protéine de type sauvage (poids) comme référence (fixée à 100 %), l'activité relative de NMPylation (moyenne ± SEM) a été calculée à partir de trois expériences indépendantes.(D) Les titres de virus dans le surnageant de culture cellulaire p1 de cellules Huh-7 infectées par des cellules Huh-7 de type sauvage HCoV-229E et les mutants portant des substitutions d'acides aminés désignées dans nsp9 ont été déterminés par test sur plaque.Le double mutant DD4823/4AA du motif C RdRp déficient en réplication a été utilisé comme contrôle négatif.
L'extrémité N de nsp9 (en particulier les positions 1, 2, 3 et 6) est très conservée parmi les membres de la sous-famille des Orthocoronavirinae (annexe SI, figure S6).Afin d'étudier le rôle possible de ces résidus dans la NMPylation de nsp9 médiée par nsp12, deux résidus Asn consécutifs à l'extrémité N-terminale de nsp9 ont été remplacés par Ala ou Ser (seuls ou en combinaison).Par rapport au nsp9 de type sauvage, le remplacement de N3825 par Ala ou Ser a entraîné une réduction de plus de deux fois de l'UMPylation médiée par nsp12 (Figure 5C).Conformément à notre conclusion selon laquelle la NMPylation se produit au niveau de l'amine primaire N-terminale au lieu de la chaîne latérale du résidu N-terminal, nous avons observé une NMPylation résiduelle significative avec le remplacement de N3825A et N3825S.Fait intéressant, si le deuxième Asn est remplacé par Ala ou Ser, l'UMPylation de nsp9 est réduite plus fortement (plus de 10 fois), tandis que le remplacement de Ala aux positions 3, 4 et 6 n'a qu'un effet modéré sur l'UMPylation de nsp9 (Figure 2). ) .5C).Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant ATP, CTP ou GTP (annexe SI, figure S8).Collectivement, ces données indiquent le rôle clé de N2826 (position 2 dans nsp9) dans la NMPylation de nsp9.
Afin d'obtenir des preuves supplémentaires de la corrélation fonctionnelle entre l'extrémité N-terminale de nsp9 et la NMPylation, nous avons effectué un alignement de séquences multiples (MSA) de la séquence nsp9 de la famille des coronavirus (variant entre 104 et 113 résidus) (Annexe SI, Figure S6).Au total, chez 47 espèces (connues et putatives) de 5 genres de la sous-famille des Orthocoronavirinae qui infectent différents hôtes mammifères, oiseaux et reptiles, seuls 8 résidus au total se sont révélés invariants.Les changements les plus importants, y compris les délétions et les insertions, ont été observés dans les cycles entre les éléments de structure secondaires de nsp9, comme déterminé par des études structurelles antérieures (26 ??28).Cinq résidus invariants ont été trouvés dans le brin β et l’hélice α de la partie C-terminale de nsp9.Trois résidus invariants constituent le motif NNE de l'extrémité N de nsp9.Il est révélé que le deuxième Asn de ce motif est le seul résidu invariant, qui est également partagé par l’hypothétique nsp9 du coronavirus de grenouille lointainement apparenté, et représente l’espèce Microhyla letovirus 1 dans la sous-famille des Letovirinae des Alphaletovirus.La conservation des résidus dans les éléments de structure secondaire de nsp9 peut être rationalisée par des considérations structurelles afin de maintenir le repliement ou les propriétés connues de liaison à l'ARN.Cependant, ce raisonnement ne semble pas s'appliquer à la conservation du NNE, et avant cette étude, la nature des contraintes qui limitent la variation de la séquence tripeptidique était complètement obscurcie.
Afin de déterminer l’importance de la nsp9-NMPylation et de la conservation du NNE dans la réplication du coronavirus, nous avons produit des mutants HCoV-229E, qui portent des substitutions simples ou doubles des résidus N-terminaux de nsp9, indiquant que la nsp9 NMPylation est nocive in vitro.Avant de commencer, nous essayons de répondre à la question de savoir si ces substitutions (près du site de clivage nsp8|9) affectent le traitement protéolytique de la région pp1a C-terminale.Un ensemble de constructions polyprotéiques nsp7-11 contenant les substitutions correspondantes à l'extrémité N-terminale de nsp9 ont été produites dans E. coli et coupées avec du Mpro recombinant.Le clivage protéolytique des quatre sites (y compris le site adjacent à nsp9) n'est pas affecté de manière significative par les substitutions introduites (annexe SI, figure S9), à l'exclusion des changements structurels de ces protéines qui interfèrent avec le clivage nsp8|9 médié par Mpro (ou autre) site web.
Les cellules Huh-7 ont été transfectées avec de l'ARN HCoV-229E de longueur génomique, codant pour des substitutions Ala ou Ser dans les tripeptides NNE conservés (N3825, N3826 et E3827) à l'extrémité nsp9 N, montrant que la plupart des mutations sont mortelles.Nous avons pu sauver le virus en remplaçant Ser ou Ala de l'Asn N-terminal (N2835A ou N2835S), mais nous n'avons pas réussi à récupérer le virus avec d'autres mutations simples et doubles dans la séquence NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figure 5D).
Ces résultats indiquent que la réplication des coronavirus en culture tissulaire est restreinte (identique ou similaire), limitant la mutation naturelle des sites de NMPylation nsp9 dans l’organisme et confirmant le rôle clé de cette réponse dans le cycle de vie des coronavirus.
Dans la dernière série d’expériences, nous avons produit le SARS-CoV-2 nsp12 et nsp9 marqué par His6 C-terminal, ainsi que deux formes mutantes de nsp12 dans E. coli.Les résidus du site actif dans les domaines NiRAN et RdRp étaient respectivement utilisés à la place de Ala (figure 6A et annexe SI, tableau S2).K4465 dans SARS-CoV-2 nsp12 correspond à K4135 dans HCoV-229E (Annexe SI, Figure S2), qui s'est avéré nécessaire pour l'activité NiRAN et la réplication du HCoV-229E (Figures 3D et E).Ce résidu correspond également au résidu EAV nsp9 K94 du virus artériel, qui s'est révélé précédemment nécessaire à l'auto-UMPylation/auto-GMPylation de NiRAN (16).Comme le montre la figure 6B, le SARS-CoV-2 nsp12 a une activité UMP transférase en utilisant nsp9 comme substrat, tandis que le mutant du site actif nsp12_K4465A est inactif.La double substitution dans la séquence caractéristique SDD du motif C RdRp n'affecte pas l'activité de l'UMP transférase (Figure 6B), ce qui indique que l'activité de RdRp n'a aucun effet direct sur l'UMPylation de nsp9.Des données similaires ont été obtenues en utilisant CTP, GTP et ATP (annexe SI, figure S10).En résumé, ces données indiquent que la NMPylation de nsp9 médiée par NiRAN a une activité conservatrice dans les coronavirus représentant différents genres de la sous-famille des orthocoronavirus.
NMPylation de nsp9 médiée par le SRAS-CoV-2 nsp12.(A) Gel SDS-polyacrylamide coloré au Coomassie montrant la protéine recombinante utilisée dans le test de NMPylation.Comme contrôle, une protéine mutante avec substitution de site actif dans le domaine NiRAN (K4465A) et le domaine RdRp (DD5152/3AA) du SARS-CoV-2 nsp12 a été utilisée.La numérotation des résidus est basée sur la position dans pp1ab.(B) Autoradiographie de la détection de l’UMPylation utilisant nsp9-His6 et [α-32P]UTP comme substrat de nsp12-His6 (type sauvage [wt] et mutant).La masse moléculaire (en kilodaltons) de la protéine marquée est indiquée à gauche.
Les domaines NiRAN sont généralement conservés dans les Nidovirales (16), ce qui indique qu'ils catalysent des réactions enzymatiques essentielles à la réplication du Nidovirus.Dans cette étude, nous avons pu prouver que le domaine NiRAN du coronavirus transfère la NMP (générée à partir du NTP) à nsp9, une mystérieuse protéine de liaison à l'ARN impliquée dans la réplication du virus (26 ?? 29 ), pour la déterminer comme cible naturelle et partenaire du coronavirus RTC.
Le domaine NiRAN partage trois motifs de séquence (AN, BN et CN), qui contiennent un très petit nombre de résidus conservés dans toutes les familles de l'ordre monophylétique mais hautement différencié des Nidovirales (8, 16) .Des études récentes ont montré qu'elles sont structurellement liées à une famille largement non caractérisée de protéines de type protéine kinase, initialement appelée famille SelO (17, 19, 22, 30, 31).Les protéines liées à SelO ont des replis kinases, mais manquent de plusieurs résidus de sites actifs conservés dans les kinases classiques (22, 32).Sur la base de l'orientation inverse des molécules d'ATP liées au site actif et stabilisées par des interactions spécifiques, SelO a été supposé, puis confirmé, transférer l'AMP (au lieu du phosphate) vers le substrat protéique (22), tandis qu'une autre protéine bactérienne de type SelO, YdiU, a Il a récemment été démontré qu'elle catalyse la fixation covalente de l'UMP aux résidus Tyr et His de différents substrats protéiques (33).
Afin de confirmer et d'élargir la prédiction des résidus putatifs du site actif du domaine NiRAN du coronavirus, nous avons utilisé des méthodes biochimiques et de génétique inverse pour effectuer une analyse de mutation sur le coronavirus nsp12 (Figure 3D et annexe E et SI, Figure S3 et tableau) S1â S4).Les données montrent que le remplacement des HCoV-229E K4135, R4178 et D4280 par Ala élimine l'activité in vitro de la NMP transférase et la réplication du virus dans la culture cellulaire (Figure 3D et annexes E et SI, Figure S3), confirmant leur présence dans le γ-phosphate du NTP. ( K4135, R4178) et la coordination des ions métalliques du site actif (D4280).Il a été démontré que la substitution E4145A du Glu conservé dans la gamme du virus du nid d'oiseau devrait stabiliser la position K4135 (17) pour éliminer la réplication virale, mais de manière surprenante, l'activité a été conservée dans le test de NMPylation in vitro (Figure 3D et E et Annexe SI, figure S3 et tableaux S1 à S4).Une observation similaire a été faite lorsque la substitution correspondante a été introduite dans l'homologue YdiU de Salmonella typhimurium (E130A) (33).Prises ensemble, ces données soutiennent la fonction régulatrice de ce résidu conservé plutôt que la fonction catalytique.
Le remplacement du résidu Phe conservé (F4281A) dans la gamme des nestovirus dans le domaine NiRAN du HCoV-229E (8) a entraîné une diminution de l'activité de NMPylation in vitro et une diminution significative de la réplication du virus en culture cellulaire (Figure 3D, E et SI) annexe, figure S3).Les données sont cohérentes avec la fonction régulatrice importante de ce résidu, telle que le résidu Phe du motif DFG homologue présenté précédemment.Dans les protéines kinases classiques, elle fait partie de la boucle de liaison Mg2+ et aide à assembler et à réguler la colonne vertébrale ???Nécessaire pour une activité catalytique efficace (32, 34).La substitution de Ala et Arg aux résidus K4116 (dans le motif préAN), respectivement, a éliminé la réplication virale et, comme prévu, a eu des effets différents sur l'activité de la NMP transférase in vitro, en fonction de la chaîne latérale d'acides aminés introduite (Figure 3D et annexes E et SI). , Figure S3).Les données fonctionnelles concordent avec les informations structurelles, indiquant que ce résidu a établi une interaction avec l'ATP phosphate (17).Dans le domaine NiRAN d'autres familles de virus imbriquées, la position de HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 est occupée par Lys, Arg ou His (8), indiquant que la restriction fonctionnelle de ce résidu spécifique a été assouplie.La substitution de D4188A et D4283A élimine ou réduit fortement l'activité enzymatique et élimine la réplication du virus (Figure 3).Ces deux résidus sont conservés dans la plupart (mais pas tous) des virus imbriqués (8), ce qui indique une fonction importante spécifique à la famille mais peut-être non catalytique.Des substitutions Ala de plusieurs autres résidus Lys et Asp (K4113A, D4180A, D4197A et D4273A) qui ne sont pas conservés chez les Coronaviridae ou d'autres familles de Nestioviridae (8) ont été utilisées comme contrôles.Comme prévu, ces substitutions sont largement tolérables, avec une légère diminution de l'activité enzymatique et de la réplication virale dans certains cas (Figure 3 et annexe SI, Figure S3).Dans l’ensemble, les données de mutagenèse du coronavirus sont très cohérentes avec les données d’auto-GMP et de génétique inverse de l’EAV NiRAN-RdRp (16), dans lequel l’EAV nsp9 (orthologue du coronavirus nsp12) résidu K94 (correspondant au HCoV-229E K4135) fonctions importantes), R124 (correspondant à R4178), D132 (correspondant à D4188), D165 (correspondant à D4280), F166 (correspondant à F4281).De plus, les données de mutagenèse du HCoV-229E sont cohérentes et élargies par rapport aux données de génétique inverse du SRAS-CoV précédemment rapportées (16), tout aussi très similaires à celles observées pour le motif CN correspondant Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. phénotype décrit -F219A et HCoV-229E_F4281A (Figure 3 D et E et annexe SI, Figure S3 et Tableau S1-S4).
Par rapport aux orthologues EAV (16), qui ont une nette préférence pour l'UTP et le GTP (dans la réaction d'auto-NMPylation), notre étude montre que le domaine NiRAN du coronavirus (représenté par HCoV-229E et SARS-CoV-2) peut être efficacement transférés Les quatre NMP, bien qu’il y ait une légère préférence pour l’UMP (Figures 1 et 3).La spécificité relativement faible du co-substrat spécifique du NTP est cohérente avec la structure supercomposite du SRAS-CoV-2 nsp7/8/12/13 récemment signalée, dans laquelle l'ADP-Mg2+ se lie au site actif du NiRAN, mais pas à la partie adénine. de la formation d'interactions spécifiques (17).Dans notre étude, le type de nucléotide utilisé dans la réaction de NMPylation n'a aucun effet différentiel sur l'activité de la protéine mutante (Annexe SI, Figure S3), ce qui indique qu'aucun de ces résidus n'est étroitement lié à la liaison d'une nucléobase spécifique.La base structurelle et la signification biologique potentielle des différentes préférences de co-substrat NTP observées dans les domaines NiRAN des coronavirus et des virus artériels restent à étudier ;ils peuvent être vrais ou être dus aux limites de leurs études respectives.À l’heure actuelle, on ne peut pas exclure que l’activité potentielle NMPylator du domaine NiRAN du virus artériel (par rapport à l’activité d’auto-NMPylation précédemment caractérisée) ait une préférence de co-substrat différente, en tenant compte de la similitude entre l’artériel et le coronavirus. Le domaine NiRAN est à sa limite.Comparaison basée sur une séquence (16).Par rapport à la pseudokinase SelO, qui utilise Mg2+ comme cofacteur, l’activité du coronavirus et du virus artériel NiRAN dépend de Mn2+ (16) (Figure 3C et annexe SI, Figure S1).La dépendance au Mn2+ et la préférence évidente pour l'UTP sont une caractéristique inhabituelle des protéines NMPylators, et n'ont été confirmées que récemment dans la protéine YdiU de Salmonella typhimurium, qui catalyse l'UMPylation, la protéine chaperon stricte dépendante du Mn2+, pour protéger les cellules de l'induction du stress. Pool d'ATP cellulaire ( 33).
La similarité structurelle récemment décrite entre le domaine NiRAN du coronavirus et les protéines kinases cellulaires (17, 19) fournit un soutien supplémentaire à la capacité de NiRAN à lier de manière covalente la NMP à d'autres protéines que nous avons rapportées dans cette étude.Nous avons concentré notre recherche de cibles NiRAN possibles sur les protéines codées par HCoV-229E ORF1a, qui sont connues pour assister directement ou indirectement la réplicase codée par ORF1b de RTC (12, 35).Nos expériences fournissent des preuves concluantes de la NMPylation efficace et spécifique de nsp9 (Figure 2).Si la protéine cible est utilisée dans un excès molaire 8 à 10 fois supérieur à celui de l'enzyme (nsp12), il est confirmé que nsp9 est complètement (mono)NMPisée (Figure 4).Nous avons conclu que l'interaction entre nsp12 et nsp9 est de courte durée et ne formera pas de complexe stable avec nsp9 (en l'absence d'autres sous-unités RTC).Cette conclusion est étayée par des études d’interactions protéiques sur le protéome du SRAS-CoV (35).L'analyse MS a identifié l'amine primaire du résidu N-terminal de nsp9 comme site de NMPylation (annexe SI, figure S5).La formation de la liaison phosphoramidate et du groupe amino N-terminal distingue l'activité de NMPylation médiée par NiRAN de la réaction d'AMPylation médiée par Pseudomonas syringae SelO, qui catalyse la formation d'AMP lié à l'O au niveau des résidus Ser, Thr ou Tyr Adduit peptidique ( 22), et S. typhimurium YdiU forme des adduits peptide-UMP liés à l'O (avec Tyr) et à l'UMP (liés à l'N).Les informations limitées disponibles sur la famille de protéines SelO indiquent que les membres de cette grande famille de protéines diffèrent grandement dans la formation d'adduits peptide-NMP.C’est une observation intéressante qui mérite une étude plus approfondie.
Les données obtenues dans cette étude nous ont amenés à émettre l’hypothèse que la NMPylation de nsp9 nécessite une extrémité N libre.Dans le contexte de la réplication virale, cela sera assuré par le clivage protéolytique du site de traitement nsp8|nsp9 dans la polyprotéine réplicase pp1a médiée par Mpro et pp1ab.Dans la plupart des coronavirus, la différence entre ce site spécifique (VKLQ|NNEI dans HCoV-229E) et tous les autres sites de clivage Mpro du coronavirus est qu'Asn (plutôt qu'un autre petit résidu, tel que Ala, Ser ou Gly) occupe P1â ???Localisation (36).Les données de clivage peptidique obtenues dans les premières études ont montré que l'efficacité de clivage du site nsp8|nsp9 était inférieure à celle des autres sites, indiquant que 1) ce site spécifique peut avoir un rôle régulateur dans le traitement coordonné en temps opportun du C-terminal région pp1a, ou 2) a Le rôle de l'extrémité N-terminale nsp9 spécialement conservée dans la réplication du virus (37).Nos données (Figure 5A) ont montré que la forme recombinante de nsp9 portant la véritable séquence N-terminale était effectivement NMPisée par nsp12.La séquence flanquante N-terminale a été supprimée par le facteur Xa (nsp9-His6; annexe SI, tableau S1) ou par clivage médié par Mpro (nsp7-11-His6; figure 5A et annexe SI, tableau S1).Il est important de noter que le précurseur nsp7-11-His6 non coupé contenant nsp9 a montré une résistance à la NMPylation de nsp12, ce qui est cohérent avec nos données, indiquant que l'adduit nsp9-NMP est formé par l'amine primaire N-terminale (Annexe SI, Figure S5) .Pour mieux comprendre la spécificité du substrat NiRAN, nous nous sommes ensuite concentrés sur les résidus N-terminaux adjacents de nsp9.En l'absence d'autres protéines, elles sont structurellement flexibles, ce qui les empêche d'être détectées sous la forme non marquée de nsp9 (26, 28, 38), ce qui indique leur variation naturelle limitée. Cela est dû à l'importante séquence spécifique (non liée à la structure secondaire) fonction du fragment N-terminal nsp9.Les substitutions Ala des résidus conservés dans cette région (Figures 5C et D et annexe SI, Figure S8) révèlent que N3826 est essentiel pour la NMPylation de nsp9 in vitro, tandis que les substitutions N3825A et E3827A entraînent une diminution de la NMPylation, alors que les substitutions M3829A et P3830A ne le font pas. .Affecte évidemment la NMPylation nsp9.Bien que la substitution de l'Asn N-terminal (N3825A, N3825S) n'ait qu'un effet modéré sur la NMPylation de nsp9 et la réplication du virus en culture cellulaire (Figures 5C et D), la suppression d'une séquence de résidus Asn du dipeptide N-terminal 3825-NN s'est avéré mortel pour les virus, ce qui indique qu'un résidu Asn est requis avant un autre résidu à l'extrémité N-terminale, de préférence Asn, bien qu'il semble que la substitution de résidus similaires puisse être partiellement tolérée (Figures 5B, C et D).Nous concluons que le dipeptide 3825-NN, en particulier le résidu N3826 conservé et essentiel dans la gamme des coronavirus (annexe SI, figure S6), garantit la liaison et l'orientation correctes de l'extrémité N de nsp9 dans le site actif de NiRAN.
La substitution de Ala (E3827A) au Glu conservé de toutes les sous-familles conserve la NMPylation de nsp9 in vitro mais est mortelle pour les virus en culture cellulaire (Figures 5C et D), indiquant la fonction supplémentaire de ce résidu, par exemple, dans des interactions clés (NMPylée ou non modifiée ) nsp9 N-terminus et d’autres facteurs impliqués dans la réplication du virus.Les mutations de Nsp9 n'ont pas affecté le processus protéolytique de nsp9 ou de toute nsps adjacente (39) (Annexe SI, Figure S9), ce qui indique que les phénotypes mortels de plusieurs mutations de nsp9 observées n'étaient pas causés par la dérégulation de la zone pp1a terminale du processus protéolytique C. .
Les données ci-dessus fournissent la preuve qu'après un traitement médié par Mpro du site de clivage nsp8|9 dans pp1a/pp1ab, l'extrémité N-terminale de nsp9 peut être UMPylée (ou partiellement modifiée avec une autre NMP).De plus, l'excellente conservation de l'extrémité N-terminale de nsp9 (y compris les résidus Asn singuliers et invariants dans la famille des coronavirus) et les données de génétique inverse obtenues dans cette étude (Figures 3E et 5D) nous ont amenés à conclure que la NMPylation de nsp9 décrite est biologiquement lié et essentiel à la réplication du coronavirus.Les conséquences fonctionnelles de cette modification restent à étudier, par exemple en ce qui concerne l'activité de liaison à l'ARN nsp9 (forme non modifiée) décrite précédemment (non spécifique) (2628).La NMPylation N-terminale peut également affecter l'interaction de nsp9 avec des substrats protéiques ou ARN ou la formation de différents assemblages à quatre niveaux.Ceux-ci ont été observés dans des études structurelles et ont été confirmés comme étant fonctionnellement liés à la réplication du coronavirus, bien que surtout en l'absence de cette modification (26-ââ29, 40).
Bien que la spécificité cible du domaine NiRAN du coronavirus doive encore être caractérisée plus en détail, nos données montrent que la spécificité cible protéique du domaine NiRAN du coronavirus est très étroite.Bien que la conservation des résidus de sites actifs clés (8, 16) dans le domaine NiRAN de toutes les familles de nidovirus soutient fortement l'activité du NMPylator conservé de ces protéines, l'identité des résidus de poche de liaison au substrat de ce domaine. Conservation et conservation restent à caractériser , et peuvent différer entre les différentes familles d'objectifs Nidovirales.De même, les cibles pertinentes d’autres virus imbriqués doivent encore être déterminées.Ils peuvent être des orthologues éloignés de nsp9 ou d'autres protéines, car les séquences en dehors des cinq domaines de réplicase qui sont généralement conservées dans les virus imbriqués sont moins conservées (8), y compris le réseau génomique entre Mpro et NiRAN. Parmi elles, nsp9 est situé dans le corona virus.
De plus, nous ne pouvons actuellement pas exclure la possibilité que le domaine NiRAN ait des cibles supplémentaires (y compris cellulaires).Dans ce cas, il convient de mentionner que les homologues bactériens de cette protéine émergente NMPylators (NMPylators) (30, 31) semblent avoir des « régulateurs maîtres » ?La NMP module diverses protéines cellulaires pour réguler ou éliminer leurs activités en aval, jouant ainsi un rôle dans divers processus biologiques, tels que la réponse cellulaire au stress et l'homéostasie rédox (22, 33).
Dans cette étude (Figures 2 et 4 et Annexe SI, Figures S3 et S5), nous avons pu prouver que nsp12 transférait la partie UMP (NMP) vers une position unique (conservée) dans nsp9, alors que les autres protéines n'étaient pas modifiées dans le utilisé Dans ces conditions, une spécificité de substrat bien définie (plutôt que lâche) est prise en charge.Conformément à cela, par rapport à la NMPylation de nsp9 N-terminale, la propre activité de NMPylation de nsp12 est très faible, sa détection nécessite un temps d'exposition à l'autoradiographie plus long et une augmentation de 10 fois de la concentration de nsp12 est utilisée.De plus, notre analyse MS n'a pas réussi à fournir la preuve de la NMPylation de nsp12, ce qui suggère que l'auto-NMPylation du domaine NiRAN est (au mieux) une activité secondaire.Cependant, il convient de noter que d'autres études ont fourni des preuves préliminaires selon lesquelles le statut d'auto-AMPylation du NMPylator bactérien peut contrôler son activité de NMPylation sur d'autres substrats protéiques (22, 33).Par conséquent, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour étudier les effets fonctionnels possibles des activités d'auto-NMPylation signalées pour l'EAV nsp9 (16) et le coronavirus nsp12 (cette étude), y compris l'effet de type chaperon proposé sur le repliement du domaine RdRp C-terminal ( 16) ).
Auparavant, plusieurs hypothèses concernant les fonctions possibles en aval du domaine NiRAN nidoviral ont été envisagées, notamment l'ARN ligase, la guanylate transférase coiffée par l'ARN et l'activité d'amorçage des protéines (16), mais aucune d'entre elles n'est compatible avec les fonctions en aval disponibles.Les informations obtenues dans les positions suivantes sont exactement au même moment sans faire d'hypothèses supplémentaires.Les données obtenues dans cette étude concordent le plus avec (mais ne peuvent pas prouver) que le domaine NiRAN est impliqué dans l'initiation de la synthèse d'ARN induite par les protéines.On pensait auparavant que la fonction du domaine NiRAN dans 5 ?Les réactions de coiffage de l'ARN² ou de ligature de l'ARN ne sont pas affectées par celles-ci et par la prise en charge d'autres données.Par conséquent, par exemple, on considère que le site actif de NiRAN implique l’Asp conservé comme base générale (D252 dans Pseudomonas syringae SelO ; D4271 dans HCoV-229E pp1ab ; D208 dans SARS-CoV-2 nsp12) (Annexe SI, figure 2 ).S2) (17, 22, 33), tandis que la catalyse de l'ARN ligase dépendante de l'ATP et de l'enzyme de coiffage de l'ARN est réalisée par l'intermédiaire de l'enzyme covalente-(lysyl-N)-NMP, qui implique un résidu Lys non modifié ( 41).De plus, la remarquable spécificité basée sur la séquence du coronavirus NiRAN pour les cibles protéiques conservées et la spécificité assouplie pour les co-substrats NTP (préfère l’UTP) s’opposent aux fonctions de type enzyme de coiffage médiées par NiRAN ou de type ARN ligase.
De toute évidence, beaucoup de travail supplémentaire est nécessaire pour vérifier et, s'il est prouvé, élaborer sur le rôle possible de nsp9-UMP (nsp9-NMP) dans la synthèse d'ARN induite par les protéines, ce qui reliera plusieurs rapports intéressants mais (jusqu'à présent) rapportés précédemment. .Observations isolées.Par exemple, il a été déterminé que la fin de l’ARN du brin négatif du coronavirus commence par un brin oligo(U) (42, 43).Cette observation est cohérente avec l'idée selon laquelle la synthèse de l'ARN du brin négatif est initiée par la liaison de la forme UMPylée de nsp9 à la queue poly(A) (déclencheurs), qui peut être favorisée par sa liaison à l'ARN. L'activité et/ou l'interaction avec une autre protéine RTC.La partie UMP fournie par nsp9 peut ensuite être utilisée comme « amorce » pour l'oligouridylation médiée par nsp7/8/nsp12, en utilisant la queue 3??²-poly(A) dans l'ARN génomique ou une autre séquence contenant un oligo (A). sert de modèle, similaire au mécanisme établi pour la protéine VPg du picornavirus (44).Et si la proposition est « non normative » ????L’initiation de la synthèse de l’ARN à brin négatif (induite par les protéines) fournit un lien avec les observations, indiquant que l’ARN à brin négatif du coronavirus a de l’UMP (au lieu de l’UTP) à son extrémité (42), ce qui est considéré comme indiquant que le L'acide nucléique Dicer clive l'extrémité phosphorylée par une endonucléase inconnue spécifique de l'uridine.Si elle est confirmée, cette activité hydrolytique de l’acide nucléique peut aider à libérer la forme oligomère UMPylée de nsp9 de l’extrémité 5² du brin négatif naissant.Le rôle possible de nsp9 dans l’amorçage des protéines est également cohérent avec des études antérieures de génétique inverse, qui ont montré que nsp9 (et nsp8) interagissent de manière critique et spécifique avec l’élément d’ARN agissant en cis conservé près de l’extrémité 3 du génome du coronavirus.45).Selon ce rapport, ces observations antérieures peuvent désormais être réexaminées et élargies grâce à des recherches plus approfondies.
En résumé, nos données ont déterminé l’activité spécifique d’une étiquette enzymatique virale imbriquée exclusive liée au RdRp à l’extrémité N-terminale.Dans le coronavirus, cette activité UMPylator/NMPylator médiée par NiRAN récemment découverte est utilisée pour s’appuyer sur les résidus Mn2+ et Asn adjacents et provoquer la formation de liaisons phosphoramidate (basse énergie) avec l’amine primaire N-terminale.Grâce au clivage médié par Mpro au niveau du site de clivage nsp8|9, la cible nsp9 peut être utilisée pour la NMPylation, indiquant le couplage fonctionnel entre la protéase et le domaine NiRAN, qui s'étend jusqu'à RdRp.La conservation des résidus clés dans le site actif nsp12 NiRAN et la cible nsp9, combinée aux données obtenues à partir de deux coronavirus, dont le SRAS-CoV-2, fournit des preuves solides que la NMPylation de nsp9 est un coronavirus. Les caractéristiques conservatrices sont également une étape clé dans la réplication du virus.Les données disponibles nous amènent à conclure que le rôle spécifique de la forme NMPylée de nsp9 dans la synthèse d’ARN induite par les protéines est un scénario raisonnable pour les coronavirus et d’autres virus imbriqués, et que NiRAN peut également cibler d’autres protéines non identifiées.Régulez le virus.Interaction de l'hôte.Si elle est confirmée, l'implication d'amorces protéiques dans la synthèse de l'ARN viral augmentera l'affinité de séquence des domaines Mpro/3CLpro et RdRp entre le coronavirus précédemment détecté et le supergroupe de type picornavirus (9), qui ont maintenant été unifiés dans les Pisonivirites récemment établis ( 46) dans la catégorie.
Nos données montrent également que les activités enzymatiques basiques, sélectives et conservatrices identifiées dans cette étude peuvent être utilisées comme cibles pour les médicaments antiviraux.Les composés qui interfèrent avec la liaison (et la modification ultérieure) de l'extrémité N-terminale nsp9 conservée dans le site actif de NiRAN peuvent être développés en médicaments antiviraux efficaces et polyvalents, adaptés au traitement des coronavirus animaux et humains de différents (sous) genres d'infections. , y compris le SRAS-CoV-2 et le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient.
La séquence codante de la protéine du coronavirus produite dans cette étude a été amplifiée par RT-PCR à l’aide d’ARN isolé de Huh-7 infecté par HCoV-229E ou Vero E6 infecté par le SRAS-CoV-2, et insérée à l’aide de procédures de clonage standard.Vecteur d'expression pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) ou pASK3-Ub-CHis6 (47) (annexe SI, tableaux S1 et S2).Des substitutions de codons uniques ont été introduites par mutagenèse dirigée sur site basée sur la PCR (48).Pour produire la protéine de fusion MBP, les cellules E. coli TB1 ont été transformées avec la construction plasmidique pMAL-c2 appropriée (annexe SI, tableau S1).La protéine de fusion a été purifiée par chromatographie d'affinité sur l'amylose et clivée avec le facteur Xa.Par la suite, la protéine marquée His6 C-terminale a été purifiée par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé sur Ni (Ni-IMAC) comme décrit précédemment (49).Pour produire la protéine de fusion d'ubiquitine, les cellules E. coli TB1 ont utilisé la construction plasmidique pASK3-Ub-CHis6 appropriée (annexe SI, tableaux S1 et S2) et l'ADN plasmidique pCGI codant pour l'hydrolase C-terminale 1 spécifique de l'ubiquitine (Ubp1).Transformations (47).La protéine du coronavirus C-terminal marquée His6 a été purifiée comme décrit précédemment (50).
Le test d'auto-NMPylation du HCoV-229E nsp12-His6 a été réalisé comme décrit dans EAV nsp9 (16).En bref, nsp12-His6 (0,5 µM) contient 50 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM de dithiothréitol (DTT), 6 mM de MnCl2, 25 µM de tampon, incuber le NTP spécifié et 0,17 µM correspondaient au [α32-P]NTP (3 000 Ci/mmol ; Hartmann Analytic) à 30 °C pendant 30 minutes.Dans tous les autres tests (standards) de NMPylation de NMPylation de nsp9 médiée par nsp12, les conditions de réaction sont ajustées comme suit : nsp12-His6 (0,05 µM) et nsp9-His6 (4 µM) en présence de 50 mM de HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM de DTT, 1 mM de MnCl2, 25 µM indiqués NTP et 0,17 µM correspondant au [α32-P]NTP.Après incubation pendant 10 minutes à 30°C, l'échantillon réactionnel a été mélangé avec un tampon d'échantillon SDS-PAGE : 62,5 mM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane HCl (pH 6,8), 100 mM de DTT, 2,5 % de SDS, 10 % de glycérol et 0,005 % de bromophénol. bleu.La protéine a été dénaturée par chauffage à 90 ° C pendant 5 minutes et séparée par SDS-PAGE à 12 %.Le gel est fixé et coloré avec une solution de Coomassie Brilliant Blue (40 % de méthanol, 10 % d'acide acétique, 0,05 % de Coomassie Brilliant Blue R-250), décoloré et exposé à un écran d'imagerie phosphorescent pendant 20 heures (pour détecter nsp12 de NMPylation). ou (maximum) 2 heures (pour évaluer la NMPylation nsp9).Un imageur Typhoon 9200 (GE Healthcare) a été utilisé pour numériser l'écran et ImageJ pour analyser l'intensité du signal.
Pour l'analyse MS, 1 µM de nsp12-His6 et 10 µM de nsp9 (sans étiquette hexahistidine) ont été utilisés dans l'analyse de NMPylation (annexe SI, tableau S1) et la concentration accrue de 500 µM d'UTP et de GTP a été utilisée.En fonction de leur concentration et de la qualité attendue des protéines, un système HPLC Waters ACQUITY H-Class équipé d'une colonne MassPrep (Waters) a été utilisé pour dessaler 1 à 10 µL de solutions protéiques tamponnées en ligne.La protéine dessalée est éluée dans la source d'ions électrospray du spectromètre de masse Synapt G2Si (Waters) à travers le gradient suivant de tampon A (eau/0,05 % d'acide formique) et de tampon B (acétonitrile/0,045 % d'acide formique), et la température de la colonne est de : 60°C et un débit de 0,1 mL/min : élution isocratiquement avec 5% A pendant 2 minutes, puis un gradient linéaire jusqu'à 95% B en 8 minutes, et maintenir 95% B pendant encore 4 minutes.
Des ions positifs avec une plage de masse de 500 à 5 000 m/z sont détectés.Le Glu-fibrinopeptide B est mesuré toutes les 45 secondes pour une correction automatique de la dérive de masse.Utilisez le logiciel d’instrument MassLynx avec l’extension MaxEnt1 pour déconvolutionner le spectre moyen après déduction de la ligne de base et lissage.
Le HCoV-229E nsp9 UMPylé a été digéré en ajoutant de la trypsine modifiée de qualité séquençage (Serva) et incubé pendant la nuit à 37 °C.Une colonne de centrifugation Chromabond C18WP (numéro de pièce 730522 ; Macherey-Nagel) a été utilisée pour dessaler et concentrer les peptides.Enfin, le peptide a été dissous dans 25 µL d’eau contenant 5 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide formique.
Les échantillons ont été analysés par MS à l'aide d'un spectromètre de masse Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Le système nanoâ HPLC ultime (Dionex), équipé d'un 50 cm ??Colonne C18 RP de 75 μm remplie de billes magnétiques de 2,4 μm (Dr Albin Maisch High Performance LC GmbH) Connectez-vous au spectromètre de masse en ligne via la source nanospray Proxeon ;injecter 6 µL de solution de digestion à la trypsine dans un diamètre intérieur de 300 µm × ??Colonne de préconcentration C18 PepMap de 1 cm (Thermo Scientific).En utilisant de l’eau/0,05 % d’acide formique comme solvant, l’échantillon a été automatiquement piégé et dessalé à un débit de 6 µL/min.
Les gradients suivants d'eau/0,05 % d'acide formique (solvant A) et 80 % d'acétonitrile/0,045 % d'acide formique (solvant B) ont été utilisés pour réaliser la séparation des peptides tryptiques à un débit de 300 nL/min : 4 % B pour 5 minutes, puis un gradient linéaire de 30 A jusqu'à 45 % de B en quelques minutes, et une augmentation linéaire jusqu'à 95 % de solvant B en 5 minutes.Connectez la colonne chromatographique à un nano-émetteur en acier inoxydable (Proxeon), et pulvérisez l'éluant directement sur le capillaire chauffé du spectromètre de masse en utilisant un potentiel de 2 300 V. Le balayage d'enquête avec une résolution de 60 000 dans l'analyseur de masse Orbitrap est associé avec au moins trois analyses MS/MS de données, exclues dynamiquement pendant 30 secondes, en utilisant une dissociation induite par collision par piège à ions linéaire ou une dissociation par collision à énergie plus élevée combinée à une détection orbitrap, la résolution est de 7 500.
Heure de publication : 03 août 2021